RNA pripravljena s pomoću TRI Reagenta prikladna je za RT-PCR (klasični i kvantitativni/real-time), polja (arrays), različite hibridizacije te translaciju in vitro.

Materijal tkiva se može podvrgnuti drugim dijagnostičkim metodama, kao što su: RT-PCR, IF na zamrznutim rezovima, imunohistokemija na formalinom fiksiranom materijalu tkiva.

Sudionici projekta će pokušati rekonstruirati filogenetsko stablo MATE proteina te steći iskustvo u izolaciji RNA iz tkiva, RT-PCR-u, restrikcijskim enzimima i semikvantitativnoj analizi ekspresije gena u zebrici.

Danas se za dijagnostiku virusa iz humanog materijala rutinski koristi enzimski imunoesej (EIA) te test nukleinskih kiselina (RT-PCR) koji je vrlo senzitivna i specifična metoda korisna za epidemiološka istraživanja (povezivanje različitih slučajeva bolesti sa istim izvorom).

Konvencionalne tehnike RT-PCR primijenjene na kliničkim uzorcima, s dobro definiranim početnicama (primers), mogu omogućiti brzo otkrivanje i identifikaciju podtipa (barem H5 i H7), a produkt PCR amplifikacije se može upotrijebiti za određivanje slijeda nukleotida, jer je dokazana njegova važna primjena u brzom otkrivanju novih izbijanja, nakon što su primarno zaraženi objekti otkriveni, a virus karakteriziran.

RT-PCR »u stvarnom vremenu« (Real Time RT PCR rRT-PCR), korištenjem početnica i fluorescentnih proba omogućavaju još bržu i osjetljiviju dijagnozu detekcijom virusa influence ptica i određivanjem podtipova H5 ili H7 u kliničkim uzorcima.

Važan je problem u vezi sa sustavima RT-PCR i rRT-PCR da su do danas različiti laboratoriji razvili različite sustave koji, iako posve zakoniti, nisu bili validirani, ni testirani na većem broju uzoraka u različitim laboratorijima.

Referentni laboratorij Zajednice i određeni nacionalni referentni laboratoriji bavili su se ovim problemom u okviru projekta [ EU AVIFLU ] koji je financirala Europska unija, kako bi proizveli ratificirane protokole za konvencionalne RT-PCR i rRT-PCR, koje bi mogli prihvatiti drugi nacionalni referentni laboratoriji.

Potvrđeni slučaj: Potvrda virusne infekcije virološkom pretragom (RT-PCR, izolacija virusa, Ag-ELISA ili druge metode za izravno ili neizravno utvrđivanje virusne infekcije).

U prvoj fazi bolest se dokazuje mikrobiološkim pretraga, i to metodom RT-PCR (reverzibilna transkriptazna lančana reakcija polimeraze), kad se genom virusa može dokazati, a protutijela se još nisu razvila u krvi.

RT PCR je metoda kojom se na temelju RNA sintetizira jednolančana molekula DNA koja se zatim dalje umnožava

Za dokaz patogenosti inače se koriste molekulske probe poput lančane reakcije polimerazom uz reverznu transkripciju (RT-PCR) i sekvencioniranje (Suarez, 1998., Starick, Romer-Oberdorfer i Werner, 2000., Munch i sur., 2001.).

Postoje laboratorijska testiranja pomoću seroloških i molekularnih metoda kao što se Elisa test, PCR metoda, IC-RT-PCR.

Određivanjem tumorskih biljega u citološkim uzorcima tkiva štitnjače imunocitokemijskim i RT-PCR metodama i njihovom međusobnom usporedbom očekuje se uspješnija preoperativna dijagnostika malignih tumora štitnjače.

Metodom RT-PCR odrediti će se izraženosti molekularnih biljega galektina-3, CD44v6 i PAX8/PPAR-gamma pojedinačno i/ili u kombinaciji.

Provesti cjelovito dijagnostičko testiranje, izoliranje i karakterizaciju virusa, ali se pritom usredotočiti na metode brzog otkrivanja i metode karakterizacije, osobito one koje se temelje na RT-PCR i sekvencioniranju 1.

Naime, u bolesnika koji neredovito uzimaju lijekove i kod kojih koncentracija lijekova nije dostatna da zaustavi virusno umnožavanje, u plazmi će se komercijalnim RT-PCR testom moći dokazati mjerljiva viremija (broj kopija HIV-1 RNA po mililitru plazme bit će veći od 50).

Mutacije povezane rezistencijom na antiretrovirusne lijekove otkrivaju se sekvenciranjem RT-PCR produkta koji odgovara regijama proteaze i reverzne transkriptaze u genomu virusa nakon čega slijedi usporedba dobivene sekvence s divljim tipom virusa kao referentnim standardom.

Aktivnost gena IGF pratit će se na razini ekspresije mRNA (RT-PCR) i specifičnog proteina, tj. njihovog utjecaja na proliferaciju stanica (Ki 67), apoptozu i aktivnost telomeraze.

Metode RT-PCR treba na odgovarajući način potvrditi i njihova osjetljivost mora biti najmanje jednaka osjetljivosti izolacije virusa influence A u jajima.

II.3.1. Uzorci krvi i epruvete koje sadrže tkivo riba namijenjeno za virološki pregled ili RT-PCR analizu stavljaju se u izolirane posude (npr. kutije od polistirena s debelim stjenkama) zajedno s dovoljnom količinom leda ili rashladnih blokova kako bi se osiguralo rashlađivanje uzoraka tijekom prijevoza u laboratorij.

U izuzetnim okolnostima uzorci za RT-PCR analizu ili za virološki pregled mogu se naglo zamrznuti i transportirati u laboratorij pri temperaturi od 20 C ili nižoj.

Dio IV. ovoga Dodatka propisuje postupke za pretraživanje uzoraka korištenjem RT-PCR u svrhu utvrđivanja ZAL.

c) osnovani dokaz o prisutnosti virusa ZAL od strane dva neovisna laboratorijska testa kao što su RT-PCR utvrđen u Dijelu IV. ovoga Dodatka i IFAT utvrđen u Dijelu V. ovoga Dodatka;

Potvrđeni slučaj: Potvrda virusne infekcije virološkom pretragom (RT-PCR, izolacija virusa ili druge metode za izravno ili neizravno dokazivanje virusa) u uzorcima uzetim od sumnjivog slučaja.

Ne uspiju li hrvatski stručnjaci metodom RT-PCR i serološkim ispitivanjem otkriti moguće promjene na virusu, prepustit će to kolegama u Sloveniji ili Austriji, gdje će se obaviti sekvenciranje genoma virusa jer u Hrvatskoj zasad takav laboratorij ne postoji, kaže prof. dr. Gordana Mlinarić Galinović, voditeljica Službe za mikrobiologiju i virusologiju u HZJZ-u.

Provesti brzo otkrivanje na temelju tehnike RT-PCR za M gen.

Metode izbora za identifikaciju virusa ZAL su IF utvrđene podtočkom III.6.1. ovoga Dijela Dodatka i RT-PCR utvrđene u Dijelu IV. ovoga Dodatka.

Prisutstvo potencijalnih receptora u bubregu te uspješnost transfekcije bit će istražena Western blotom i RT-PCR metodama.

Real-time RT-PCR (WNV linija 1 i 2) je bio negativan u svim testiranim uzorcima.